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单克隆抗体生产中分批、流加、灌注培养方式的比较
发布时间:2019-10-05 16:02 编辑:澳门太阳城

   

  利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产重组蛋白,占整个生物制药行业的70%以上。事实上, CHO细胞生产的人源单克隆抗体(hMAbs)在诊断和治疗市场上发挥的重要作用已有数十年。罗氏利妥昔单抗治疗非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和类风湿关节炎是首批获得FDA批准的人鼠嵌合单克隆抗体之一。自1997年获得批准以来,已有数十种嵌合、人源化和人单克隆抗体获得批准并进入临床使用。许多基于单抗的重磅治疗药物即将达到“专利期限”。甚至,许多研发机构正在进行工艺开发和优化,竞相开发生物类似药。

  图1:灌注培养用Repligen的ATF-2细胞截留装置- BioFlo 320(右),控制生物反应器(中)中的气体、pH值、DO和搅拌,Repligen控制器(左)监控通过中空纤维截留装置的压力和交替切向流。

  在所有药品工艺开发过程中,包括那些涉及CHO细胞生产的人源单抗,决定最佳工艺参数和方法是基于成本、时间和表达量的比较而做出来的。通常,在最终工艺转移到中试或扩大的实验室级别之前,要进行多管线平台测试。投入大量的研发时间和资金来提高产量,降低成本,改进现有的生物反应器和生物工艺技术。我们研究项目的目标是用一个简单、实验室规模工艺控制器比较分批、流加和灌流工艺(人员单抗生产的三种主要方法)。

  在分批法中,所有营养物质都在初始基培养基中提供。流加法是在营养物质耗尽后添加营养物质。灌注法是培养过程中不断灌注培养基,能同时清除废物、提供营养和收获产品。我们比较了在生物反应器中保留细胞方式的两种不同灌注工艺。在一个装置中,我们使用了交替切向流(ATF)过滤装置,它使用中空纤维过滤器来截留细胞。在第二个装置中,我们将细胞置于生物反应器中,并将其固定在固体载体上。

  我们用Eppendorf BioFlo320生物工艺控制站控制所有的实验运行,比较了四种人源单抗产品。需要注意的是,除了管道和马达,在单独的运行之间没有进行任何硬件更改。表1是四个试验设置的概况。

  我们把一个含有密度为0.3×106个细胞/mL的冷冻管中的细胞,接种在一个125毫升的摇瓶中,加入瓶体积20%的培养基。每隔一天传代,一周后,我们将摇瓶的大小从125 mL增大到250 mL, 500 mL,最后是1L来扩大培养体积,同时保持接种密度、培养液占摇瓶容积比例,其它参数不变。用同样方法,我们在每个生物反应器中接种了解冻后相同代次和培养时间的细胞。

  通过无菌试剂盒(0.375-in)复制ATF-2过滤装置。对于填充床灌注,我们使用了BioBLU 5p一次性设备,预填充了Eppendorf纤维蛋白片。

  生物反应器控制及工艺参数: BioFlo 320生物过程控制站控制各实验。它易于编程,可以精确控制温度、搅拌、表面和深层通气、添加和移除液体的泵,以及加热或冷凝排放尾气。它可以用传感器测量pH值、溶解氧(DO)、还原氧化和二氧化碳来进行测量和控制。

  每分钟100转的速度搅拌培养。玻璃容器和BioBLU 5c一次性设备均配备有倾斜叶片叶轮。对于填料床生物反应器,我们采用了篮式叶轮。我们使用ISM极谱传感器(Mettler Toledo)测量DO,并在三气体自动模式下,通过在0.02-1.00 SLPM流量下加空气或O2,将DO控制在50%。我们使用电位传感器(耐受高压容器)或光学pH探针(一次性设备)测量pH值,并通过级联至CO2(酸)和0.45 M碳酸氢钠(碱),将pH值控制在7.0(死区= 0.2)。

  所有培养物最终接种密度为0.30 ~ 0.45×106个细胞/mL(目标为0.3×106个细胞/mL)。我们最初在37℃培养细胞。在批量运行时,我们保持温度不变。由于增加CHO细胞蛋白表达的通常做法是将温度设至32℃,所以我们在较长的过程中降低了温度:在流加运行时,我们在开始补料时将温度降低到32℃;在灌注过程中,我们在第7天将温度调至32℃。表2总结了重要的工艺参数。四项实验采用相同接种密度、气体控制、DO控制和搅拌。

  我们每天从生物反应器中取两个样本(一个在上午,一个在晚上),检查脱机值,如pH、细胞密度、活率、葡萄糖、氨(NH3)、谷氨酸、乳酸和hMAb浓度。为了从培养中收集高质量的样品,我们连接无菌5毫升注射器到样品鲁尔接口锁,然后移除死体积5毫升。然后我们收集第二个5毫升样品在一个新的注射器,提供新鲜、活的样本分析和新鲜样品存储。后来,我们在计算补料量时考虑了每天的体积损失。

  我们使用Vi-Cell XR活性分析仪(Beckman Coulter)测量细胞密度和活率(采用台盼兰染色法),使用Orion Star 8211 pH仪(Thermo Fisher Scientific)测量pH值。使用离线pH值,我们每天重校准控制器的光学pH,以防止在线和离线测量之间的差异。我们使用Cedex生物分析仪(Roche)测量葡萄糖、NH3、谷氨酸、乳酸和hMAb。在获得脱机葡萄糖浓度的基础上,通过每日两次向培养物中注入适量的200g /L无菌葡萄糖,达到培养物的目标葡萄糖浓度。

  填充床生物反应器中,不能直接细胞计数,因为细胞生长在纤维蛋白片中或者表面。然而,有可能将细胞生长与葡萄糖消耗趋势相关联。我们分析了ATF灌注培养时细胞密度和葡萄糖消耗趋势,并利用这些结果估计了BioBLU 5p生物反应器中的细胞密度。三相葡萄糖消耗表示固定周期中的滞后期、对数期和平稳期。我们使用每个阶段的趋势线方程来计算细胞密度。

  在流加培养工艺中,我们从第3天开始,每日以CD EfficientFeed C AGT营养补充品(Thermo Fisher Scientific)按工作体积的3%喂养培养物。我们使用Eppendorf的BioCommand批处理控制、监控和数据采集(SCADA)软件实现了自动化。泵的设置点为2.5 mL/min,我们将泵设置为每天上午9点运行30分钟。图2显示了这个自动化程序。

  使用逻辑函数块,Feed Program Line 1建立了一个24小时时钟(“计数器”),在重置为零之前运行24小时。Feed Program Line 2使用计数器循环,以2.5 mL/min的设定值打开泵1,持续30分钟,从而实现每日慢速营养的自动化补料。除了使用营养饲料外,我们每天两次补加葡萄糖将培养物的最终目标浓度控制为3 g/L。为此,我们使用离线 g/L无菌葡萄糖的合适用量,如上所述。当细胞活率和培养密度开始下降时,这个过程就结束了。

  在两种灌流工艺中,我们都按上述方法进行了bolus葡萄糖补料,最终目标浓度为3 g/L。在ATFenabled灌注时,我们按照制造商的推荐将过滤速率设置为1 L/min。第12天细胞密度上升至60×106细胞/mL。为了防止过滤器堵塞,我们将ATF流量增加到1.2 L/min,一直保持到实验结束。

  在培养过程中,细胞密度达到某一点时,DO的需求过高,达到了1-SLPM最大流加量程度。因此,我们使用相同的三气体自动放气控制算法,使用了5-SLPM最大流加量。但是管子从控制器的表层连接到深层。因此,可以实现最大流量为5 SLPM。

  在两个灌注实验中,我们都确定灌注率如下:以生长速度和代谢物浓度为指标,基于培养健康,我们稳定增加了每天设备体积灌注率(VVD)。我们的最终目标是通过调节葡萄糖浓度和灌注速率,使NH3水平保持在6 mmol/L,防止乳酸盐的消耗。表3列出了我们随时间所做的调整。用上述方法制备的培养基进行灌流,但进行了一项修改:灌流谷氨酰胺浓度为2 mM。我们减少谷氨酰胺补加浓度,来减少氨的产生。

  分批培养:第6天,分批培养过程中活细胞密度达到峰值1.5×107个/mL,随后急剧下降。第5天,细胞耗尽了最初提供的葡萄糖。第4天乳酸浓度增加到2.2 g/L。时间退役到葡萄糖浓度下降时,然后细胞密度下降-这表明细胞经历了一个代谢转换,从葡萄糖消耗到乳酸消耗。氨浓度在第9天持续升高至9 mmol/L(图1),细胞死亡。9天内,培养共产生0.9 g hMAb。

  流加培养:流加工艺中,我们从第3天开始,每天给培养物添加葡萄糖和CD EfficientFeed C AGT营养补充品。因此,整个过程中葡萄糖浓度始终保持在3 g/L。我们达到了2×107细胞/mL的活细胞密度峰值。与分批培养相比,即使培养14天后,细胞存活率仍然接近100%,这很可能是由于葡萄糖和其他营养物质的持续供应。补料培养也推迟了乳酸消耗的开始,开始于第5天左右,直到第10天未完全。

  同样,前五天内的过程中,氨浓度增加到~ 4 mmol/L,然后在攀升到有毒的水平之前(图2)临时回落到初始水平。这一现象是由于新陈代谢的变化发生在应对高的乳酸浓度时,已经记录在16天(9)。16天内,培养产生了hMAb总额4.5克。

  灌注培养:我们比较了两种灌注工艺,使用不同的方法截留细胞。ATF过滤法灌注14天,填充床灌注21天。前者在90%存活率时达到细胞密度峰值7.4×107个/mL,总抗体表达量11.5 g。后者的细胞密度峰值为~ 6×107个/mL,产生抗体7.4 g。我们分别将两种工艺的灌注率提高到1.8 VVD和1.7 VVD的最大值(表3)。

  对于两种灌注培养,我们的把葡萄糖目标值定为≥3 g/L。在ATF工艺中,葡萄糖浓度发生了变化。这可以归因于这样一个事实,即消耗率远远高于流加培养工艺中,保障细胞的需求是具有挑战性的。在填充床灌注工艺中,我们期望高消耗率,从而使葡萄糖水平更加稳定。在这两种工艺中,乳酸浓度均小于2.5 g/L,这与流加培养工艺相比提供了不同的氨轨迹。根据我们的灌注速率变化,氨水平升高和降低(图3和图4)。

  BioFlo 320系统允许生物过程方案之间的无缝转换,这使我们能够使用一个生物过程控制站比较批式培养、流加培养和灌注培养工艺的性能。这对我们的研究至关重要,因为方法之间转换的方便性是我们评估的一部分。

  在ATF灌注工艺中,我们获得了值得注意的细胞密度峰值7.4×107个/mL,两周内产生了11.4 g抗体。这意味着,与我们的批式和流加工艺相比,产品产量分别增加了12倍和2.5倍。在ATF灌注工艺中,使用类似的单抗生产CHO细胞系生产抗体的情况比其它地方报道的高两倍(10)。

  选择哪种培养模式用于生产取决于预算、可用时间和所需的hMAb数量。简单的批次培养可能是生产非常少量hMAb的最便宜和最快的方法,因为使用简单的设备和工艺,在最短的5天时间内进行最少的人为干预,培养基的量也相对较低。流加培养使hMAb产量增加了5倍,但周期长,需要更多的人为干预和更复杂的设备,尽管培养基用量低。

  尽管ATF灌注法提供了最高的活细胞密度和hMAb产量,然而,它需要额外的资金投入,需要实验室空间用于安放ATF过滤装置和控制器,复杂设备的操作,采多个日常样品,并监测容器体积。它还使用了大量的细胞培养基。装填床容器的安装只需要简单地将其连接到控制站,即可对容器体积进行标准监测,取样也不复杂。此外,该方法产生的峰值细胞密度接近ATF工艺,但没有额外的昂贵设备或复杂的操作。

  由于减少了生产周期和交叉污染风险,一次性设备在生物工艺开发中的应用正在上升。我们成功地将BioBLU一次性设备用于流加工艺以及两种灌注培养模式。添加ATF过滤装置和在填充床容器中使用固体生长支持基质都可以使细胞截留简单,提高细胞密度和产品产量。通过长时间的灌注培养,在一次接种后连续两到三个月的抗体收获,可以获得更高的生产力。




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